Die Handlung spielt um 63 v. Chr. in der Stadt Nymphaeum. König Mitridate von Pontus wird irrtümlich für tot gehalten, nachdem er angeblich im Kampf gegen die einmarschierenden Römer gefallen ist. In seiner Abwesenheit buhlen seine beiden Söhne, Farnace und Sifare, um die Liebe seiner Verlobten, der griechischen Prinzessin Aspasia. Sifare bleibt seinem Vater treu und leistet den Römern Widerstand, während der verräterische Farnace offen mit ihnen paktiert.

Mitridate kehrt unerwartet zurück, da er seinen Tod nur vorgetäuscht hatte, um die Treue seiner Söhne zu prüfen. Er erfährt schnell von Farnaces Verrat und der Rivalität seiner Söhne um Aspasia. Es entfaltet sich ein Netz aus Lügen, Eifersucht und politischer Verschwörung. Mitridate, entschlossen, die Verräter zu bestrafen und sein Königreich zu sichern, sieht sich sowohl äußeren Bedrohungen durch die Römer als auch inneren Konflikten in seiner Familie gegenüber. Schließlich bereut Farnace. Im letzten, dramatischen Akt tötet sich Mitridate selbst, da er erkennt, dass seine Sache verloren ist und er den Tod der Gefangennahme vorzieht. Er drängt Sifare und Aspasia zur Vereinigung und überlässt Sifare den Kampf gegen Rom.